解读Seurat：单细胞数据可视化和聚类分析
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术 revolutionized 了生物医学研究，使我们能够以前所未有的分辨率探究细胞异质性。然而，scRNA-seq数据的高维度和复杂性也带来了巨大的分析挑战。Seurat，一个基于R语言的开源软件包，为scRNA-seq数据的质控、分析和可视化提供了一套强大的工具。本文将深入探讨Seurat的功能，涵盖从数据预处理到下游分析的各个方面，并结合实际案例进行说明。
一、数据预处理和质量控制
高质量的数据是可靠分析的基础。Seurat 提供了一系列函数用于数据预处理和质量控制，包括：
- 数据读取: Seurat 支持多种scRNA-seq数据格式，例如10X Genomics的输出、Cell Ranger的输出以及其他矩阵格式。
Read10X、ReadH5AD等函数可以方便地读取数据。 - 创建Seurat对象:
CreateSeuratObject函数将读取的数据转换为Seurat对象，这是Seurat进行后续分析的核心数据结构。该函数可以设置筛选标准，例如每个细胞检测到的基因数和每个基因检测到的细胞数，以去除低质量的细胞和基因。 - 质量控制指标计算: Seurat 可以计算多种质量控制指标，例如每个细胞检测到的UMI总数、每个细胞检测到的基因数、线粒体基因比例等。
PercentageFeatureSet函数可以计算特定基因集（例如线粒体基因）的表达比例。 - 数据过滤: 根据质量控制指标，可以使用
subset函数过滤掉低质量的细胞，例如UMI数量过低或过高、检测到的基因数量过少或线粒体基因比例过高的细胞。 - 数据标准化: scRNA-seq数据通常存在测序深度差异，需要进行标准化处理。Seurat 提供了多种标准化方法，例如
NormalizeData函数默认使用的 “LogNormalize” 方法，将每个细胞的UMI计数除以该细胞的总UMI计数，再乘以一个缩放因子（默认为10,000），最后进行对数转换。 - 高变基因识别: 高变基因（Highly Variable Genes，HVGs）是指在不同细胞之间表达差异较大的基因，这些基因通常与细胞类型或状态的差异相关。Seurat 提供了
FindVariableFeatures函数，使用多种方法（例如vst方法）识别HVGs。
二、降维、聚类和可视化
处理完数据后，我们需要对高维数据进行降维、聚类和可视化，以便理解细胞群体的结构和关系。
- 降维: Seurat 主要使用主成分分析（PCA）对数据进行降维。
RunPCA函数执行PCA，并可以选择使用HVGs作为输入。 - 确定重要主成分: 并非所有主成分都对细胞异质性有贡献。Seurat 提供了多种方法，例如基于JackStraw方法的
JackStrawPlot函数和基于肘部法的ElbowPlot函数，帮助确定重要主成分的数量。 - 聚类: Seurat 使用基于图的聚类算法对细胞进行聚类。
FindNeighbors函数构建细胞之间的k近邻图，FindClusters函数在k近邻图上进行聚类。分辨率参数（resolution）控制聚类的粒度，较高的分辨率会产生更多的聚类。 - 可视化: Seurat 支持多种降维可视化方法，例如t-SNE（
RunTSNE）和UMAP（RunUMAP），将高维数据投影到二维或三维空间，以便观察细胞的聚类结构。
三、差异表达分析和细胞类型注释
识别不同细胞群体之间的差异表达基因是理解细胞异质性的关键。
- 差异表达分析: Seurat 提供了
FindMarkers函数，可以使用多种统计方法（例如Wilcoxon秩和检验、t检验）识别不同细胞群体之间的差异表达基因。 - 细胞类型注释: 根据差异表达基因，可以推断每个细胞群体的细胞类型。可以使用已知的细胞类型标记基因或参考数据集进行注释。Seurat 提供了
AddModuleScore函数，可以计算每个细胞的基因集评分，帮助进行细胞类型注释。
四、轨迹推断和拟时间分析
对于发育或分化过程中的细胞，轨迹推断和拟时间分析可以帮助理解细胞状态的动态变化。
- 轨迹推断: Seurat 集成了多种轨迹推断方法，例如Monocle 3。
- 拟时间分析: 拟时间分析可以将细胞沿着轨迹排序，反映细胞状态的变化顺序。
五、整合多个数据集
Seurat 提供了强大的数据集整合功能，可以整合来自不同样本、不同实验条件或不同测序平台的scRNA-seq数据。
- 数据整合:
IntegrateData函数可以整合多个Seurat对象，消除批次效应，并识别跨数据集的共有细胞类型。
六、高级应用和扩展
Seurat 还在不断发展，并提供了许多高级应用和扩展，例如：
- 空间转录组学数据分析: Seurat 可以分析空间转录组学数据，将基因表达信息与空间位置信息结合起来。
- 单细胞ATAC-seq数据分析: Seurat 可以分析单细胞ATAC-seq数据，研究染色质开放性。
- 与其他R包的整合: Seurat 可以与其他R包无缝集成，例如用于基因集富集分析的clusterProfiler和用于可视化的ggplot2。
七、案例分析：PBMC数据集
以下是一个简单的案例，展示如何使用Seurat分析外周血单核细胞（PBMC）数据集：
“`R
library(Seurat)
读取数据
pbmc.data <- Read10X(data.dir = “path/to/pbmc_10k_v3”)
创建Seurat对象
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = “pbmc3k”, min.cells = 3, min.features = 200)
质控和数据过滤
pbmc[[“percent.mt”]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = “^MT-“)
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
标准化、高变基因识别、降维和聚类
pbmc <- NormalizeData(pbmc)
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc)
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
可视化
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
DimPlot(pbmc, reduction = “umap”)
差异表达分析和细胞类型注释
markers <- FindAllMarkers(pbmc)
… 后续分析 …
“`
总结:
Seurat 是一个功能强大的scRNA-seq数据分析工具，提供了从数据预处理到下游分析的全套流程。本文详细介绍了Seurat的主要功能和应用，并结合案例进行了说明。随着单细胞技术的不断发展，Seurat 也在不断更新和完善，为我们深入理解细胞异质性提供了强有力的支持。 通过学习和掌握Seurat，研究人员可以更好地挖掘scRNA-seq数据中的宝贵信息，推动生物医学研究的进步。