如何使用 ImageJ 进行图像分析 – wiki基地

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ImageJ 图像分析深度指南：从基础到进阶

图像分析在科学研究、工业检测、医学诊断等众多领域扮演着至关重要的角色。它使我们能够从视觉数据中提取定量信息，从而支持决策、验证假设或发现新的规律。在众多的图像分析工具中，ImageJ 凭借其开源、免费、跨平台、功能强大且高度可扩展的特性，成为了全球研究人员和工程师广泛使用的首选工具之一。

本文将为您提供一份详尽的 ImageJ 使用指南，从软件的安装与基本操作讲起，逐步深入到核心的图像处理和分析技术，包括测量、计数、分割、滤波等，并介绍如何利用插件和宏进一步提升分析效率。无论您是初次接触 ImageJ，还是希望系统学习其高级功能，本文都将为您提供宝贵的参考。

第一部分：ImageJ 的初步认识与准备

1. 什么是 ImageJ？为何选择它？

ImageJ 是一个基于 Java 的公共领域图像处理程序，由美国国立卫生研究院 (NIH) 的 Wayne Rasband 开发。它的设计目标是提供一个强大、灵活且易于使用的平台，用于处理和分析各种类型的图像数据。

选择 ImageJ 的主要理由包括：

• 免费与开源： 用户可以自由下载、使用、分发和修改。
• 跨平台： 可以在 Windows、macOS 和 Linux 等操作系统上运行。
• 功能丰富： 内置了大量的图像处理、分析、测量和可视化功能。
• 强大的可扩展性： 支持通过插件 (Plugins) 和宏 (Macros) 添加新功能，形成了一个庞大的用户和开发者社区生态系统。
• 广泛的应用领域： 在生物医学（细胞计数、荧光定量、形态学分析）、材料科学、工业检测、教育等领域有着广泛的应用。

ImageJ 与 Fiji 的关系：

您可能会听到 ImageJ 和 Fiji 这两个名称。Fiji (Fiji Is Just ImageJ) 是一个捆绑了 ImageJ 本体和大量常用插件、更新管理器的发行版。对于绝大多数用户而言，推荐直接下载和使用 Fiji，因为它省去了单独安装和配置常用插件的麻烦。本文后续的操作描述主要基于 Fiji，但核心功能在标准的 ImageJ 中也是相同的。

2. 获取与安装 ImageJ (Fiji)

访问 Fiji 官方网站 (https://fiji.sc/)。根据您的操作系统下载相应的安装包。安装过程通常非常简单，只需解压下载的文件到一个您喜欢的位置即可，无需传统的安装向导。

下载并解压后，找到 Fiji.app (macOS) 或 Fiji.exe (Windows/Linux) 文件，双击即可启动 ImageJ 环境。

3. 初识 ImageJ 用户界面

启动 ImageJ 后，您会看到几个主要的窗口：

• 主工具栏窗口： 这是 ImageJ 的核心控制面板，包含了菜单栏 (Menu Bar) 和工具栏 (Tool Bar)。
  • 菜单栏： 位于窗口顶部，包含 File (文件)、Edit (编辑)、Image (图像)、Process (处理)、Analyze (分析)、Plugins (插件)、Window (窗口)、Help (帮助) 等菜单。几乎所有的 ImageJ 功能都可以通过这些菜单访问。
  • 工具栏： 位于菜单栏下方，包含了一系列用于选择区域 (ROI)、测量、缩放、抓手等常用操作的图标按钮。
• 状态栏： 位于主工具栏窗口的底部，显示当前操作的提示、光标位置、像素值、内存使用情况等信息。
• 图像窗口： 当您打开一个图像文件时，它会显示在一个单独的图像窗口中。每个图像窗口都有自己的标题栏，显示文件名和图像属性。
• 结果窗口 (Results Window)： 当您执行测量或分析操作后，定量结果会显示在这个窗口中。

第二部分：基本图像处理与操作

在进行复杂的图像分析之前，通常需要对原始图像进行一些基本的处理。

1. 打开与保存图像

• 打开：
  • 点击菜单栏的 File > Open...，然后选择要打开的图像文件。
  • 或者更便捷地，直接将图像文件从文件浏览器拖放到 ImageJ 的主工具栏窗口上。
  • ImageJ 支持多种图像格式，包括 TIFF (.tif), JPEG (.jpg), PNG (.png), GIF (.gif), DICOM (.dcm) 等。
• 保存：
  • 点击菜单栏的 File > Save As >，选择您希望保存的格式（如 Tiff, Jpeg, Png 等）。TIFF 格式是无损压缩或不压缩的，通常是保存分析中间结果或最终结果的首选，因为它能保留图像的全部信息（包括多通道、多层、标定信息等）。

2. 图像显示与导航

• 缩放 (Zoom)：
  • 工具栏中的放大镜工具 (Zoom Tool)。点击图像放大，按住 Alt 键点击缩小。
  • 菜单栏 Image > Zoom >。
  • 快捷键：+ 放大，- 缩小。
• 平移 (Pan)：
  • 选中工具栏的抓手工具 (Hand Tool)。
  • 或者在任意工具下，按住空格键，鼠标变成抓手图标，然后拖动鼠标。
• 调整显示 (Adjust Window/Level)：
  • 对于灰度图像，可以通过 Image > Adjust > Brightness/Contrast... 调整图像的显示范围（最小/最大像素值）。这不会改变原始像素数据，只影响显示效果。在弹出的窗口中，您可以拖动滑块或点击 Auto 自动调整。这对于观察图像细节非常有用。
  • 对于多通道图像（如荧光图像），可以通过 Image > Color > Channels Tool... 或 Image > Hyperstacks > HyperStack Tool... 控制每个通道的显示和颜色。

3. 图像类型与位深 (Image Types and Bit Depth)

理解图像类型对于正确的分析至关重要：

• 8-bit (灰度): 每个像素用 8 位表示，可以有 2^8 = 256 个灰度级（通常从 0 到 255）。适用于常规灰度图像。
• 16-bit (灰度): 每个像素用 16 位表示，可以有 2^16 = 65536 个灰度级。常用于高动态范围的图像，如科学相机拍摄的原始图像，保留了更多的定量信息。
• 32-bit (实数): 每个像素用 32 位浮点数表示。用于存储计算结果，如滤波后的图像、像素值可以是任意实数。
• RGB Color (彩色): 每个像素由红 (R)、绿 (G)、蓝 (B) 三个通道的 8 位值组成，共有 24 位。适用于标准彩色照片。
• Indexed Color (索引色): 使用一个颜色查找表 (LUT) 来定义颜色。

您可以通过 Image > Type > 菜单更改图像类型。注意： 从高位深转换为低位深（如 16-bit 转 8-bit）或从彩色转灰度可能会丢失信息。通常建议在分析过程中保持原始位深，直到需要可视化或保存为特定格式。

4. 基本图像处理操作

• 裁剪 (Cropping):
  • 使用工具栏的矩形选区工具 (Rectangle Tool) 在图像上绘制一个矩形区域。
  • 点击菜单 Image > Crop。图像将被裁剪到选定的区域。
• 旋转与翻转 (Rotation and Flipping):
  • Image > Transform > 提供旋转 90 度、任意角度旋转以及水平/垂直翻转的选项。
• 调整亮度/对比度 (Brightness/Contrast):
  • Image > Adjust > Brightness/Contrast... (前面已提及，主要影响显示)。
• 阈值化 (Thresholding):
  • Image > Adjust > Threshold...。这是一个将灰度图像转换为二值图像（只有黑和白两种颜色）的过程。通过设置一个阈值，像素值高于阈值的变为白色（前景），低于的变为黑色（背景），或反之。这是许多分割和计数任务的关键预处理步骤。ImageJ 提供了多种自动阈值算法（如 Default, Otsu, Yen 等），也可以手动调整。点击 Apply 后，图像会真正变成二值图像。
• 滤波 (Filtering):
  • Process > Filters > 包含各种空间滤波操作。
    • 平滑 (Smoothing)： 如 Gaussian Blur (高斯模糊), Median (中值滤波)。用于去除噪声，但会牺牲图像细节。中值滤波对椒盐噪声特别有效。
    • 锐化 (Sharpening)： 如 Sharpen (锐化), Unsharp Mask (反锐化掩模)。用于增强图像边缘和细节，但可能放大噪声。

第三部分：核心图像分析技术

这是 ImageJ 最强大的部分，用于从图像中提取定量数据。

1. 设置空间标定 (Setting the Scale)

如果您想进行有意义的测量（如长度、面积），而不是仅仅计算像素数量，设置空间标定是第一步，也是最重要的一步。

• 在图像上找到一个已知实际尺寸的参照物（如刻度尺、已知大小的珠子、显微镜的刻度条）。
• 使用工具栏的直线选区工具 (Straight Line Tool) 沿着参照物绘制一条直线。
• 点击菜单 Analyze > Set Scale...。
• 在弹出的窗口中：
  • Distance in pixels: ImageJ 会自动填入您绘制的直线的像素长度。
  • Known distance: 输入参照物的实际长度。
  • Unit of length: 输入实际长度的单位（如 μm, mm, cm）。
• 勾选 Global 如果这个标定适用于所有打开的图像（如果它们是使用相同放大倍数和设置拍摄的）。
• 点击 OK。

设置标定后，ImageJ 在进行后续测量时就会自动将像素单位转换为实际物理单位。您可以在状态栏看到当前的标定信息。

2. 区域选择工具 (Region of Interest – ROI Tools)

在 ImageJ 中进行测量和分析，首先需要定义您感兴趣的区域 (ROI)。工具栏提供了一系列 ROI 工具：

• 点工具 (Point Tool): 用于标记单个点或多个点。
• 直线工具 (Straight/Segmented/Freehand Line Tools): 用于测量距离。
• 矩形工具 (Rectangle Tool): 选择矩形区域。
• 椭圆工具 (Oval Tool): 选择椭圆区域。
• 多边形工具 (Polygon Tool): 选择任意形状的多边形区域。
• 手绘工具 (Freehand Tool): 选择任意形状的自由绘制区域。
• 魔棒工具 (Wand Tool): 自动选择相似像素值的连续区域（对于背景均一的对象非常有用）。

您可以按住 Shift 键添加多个 ROI 到同一个列表中，按住 Alt 键从当前 ROI 中减去一个区域。使用 Shift+Alt 可以保留两个 ROI 相交的部分。

选定的 ROI 会显示在图像上。您可以通过 Edit > Selection > 菜单对选区进行修改（如反选、创建蒙版等）。

3. 设置测量参数 (Set Measurements)

在执行测量之前，需要告诉 ImageJ 您想测量哪些属性。

• 点击菜单 Analyze > Set Measurements...。
• 在弹出的窗口中，勾选您需要的测量项：
  • Area: 选区包含的像素数量或实际面积（如果设置了标定）。
  • Mean gray value: 选区内像素的平均灰度值。
  • Standard deviation: 选区内像素灰度值的标准差。
  • Min & max gray value: 选区内像素的最小和最大灰度值。
  • Perimeter: 选区边界的周长。
  • Length: 对于直线选区，测量长度。
  • Centroid: 选区的几何中心坐标。
  • Bounding rectangle: 包含选区的最小矩形参数。
  • Circularity: 描述选区形状接近圆形的程度 (1.0 表示完美圆形)。
  • 还有更多高级选项，如 Feret’s Diameter (最大最小直径)、Integrated Density (总像素值，等于 Area * Mean Gray Value) 等。

勾选完毕后，点击 OK。这些设置将应用于后续的测量操作。

4. 执行测量 (Measure)

有两种主要的方式执行测量：

• 对当前选区测量：

  • 在图像上绘制一个 ROI。
  • 点击菜单 Analyze > Measure。或者使用快捷键 Ctrl+M (Windows/Linux) / Cmd+M (macOS)。
  • 结果将显示在“Results”窗口的一行中。

• 对多个选区或对象测量 (Analyze Particles):

  • 这是用于自动化计数和测量图像中多个离散对象（如细胞、颗粒）的强大工具。通常需要先对图像进行预处理，使其成为二值图像，其中对象是白色，背景是黑色。
  • 步骤：
    1. 预处理： 根据需要对原始图像进行滤波降噪 (Process > Filters)。
    2. 阈值化： 使用 Image > Adjust > Threshold... 将图像转换为二值图像。调整阈值，直到目标对象被很好地分割出来。点击 Apply。
    3. 执行 Analyze Particles： 点击菜单 Analyze > Analyze Particles...。
    4. 设置参数：
       • Size (pixel^2): 设置要分析的对象的大小范围（最小面积和最大面积）。小于最小面积或大于最大面积的对象将被忽略。
       • Circularity (0.00-1.00): 设置要分析的对象的圆度范围。1.0 表示完美圆形，0.0 表示非常不规则的形状。可以用来排除非目标对象。
       • Show: 选择结果显示方式。例如 Nothing (只在结果窗口显示数据), Outlines (在原始图像上绘制对象轮廓), Masks (显示二值蒙版), Count Masks (显示每个对象的编号) 等。
       • Display results: 勾选此项会在 Results 窗口显示测量数据。
       • Clear Results: 在开始新分析前清空 Results 窗口。
       • Add to Manager: 将找到的对象添加到 ROI Manager (一个管理多个 ROI 的窗口)。
       • Exclude on edges: 排除那些接触图像边界的对象。
       • Reset Threshold: 如果您在 Analyze Particles 窗口内部进行了阈值调整，勾选此项会重置为默认值。
       • Watershed: 尝试分割相互接触的对象。这对于密集分布的对象非常有用，可以避免将多个接触的对象识别为一个。
    5. 运行： 点击 OK。ImageJ 会扫描二值图像，根据您设置的参数识别对象，并在 Results 窗口显示测量数据，同时根据 Show 设置在图像上进行标记。

5. 结果窗口 (Results Window)

所有的测量结果都会汇总在 Results 窗口。

• 每一行代表一个被测量或被分析的对象/区域。
• 每一列代表一个测量属性（如 Area, Mean, Perimeter 等），列名与您在 Set Measurements 中勾选的选项对应。
• 您可以通过 File > Save As... 将 Results 窗口中的数据保存为 CSV (Comma Separated Values) 文件，方便在电子表格软件（如 Excel）或统计软件中进一步处理和分析。
• Results 窗口还提供一些基本功能，如复制选中的行 (Edit > Copy)，清空结果 (Edit > Clear Results)。

6. ROI Manager (ROI 管理器)

当您需要管理多个选区时，ROI Manager 非常有用。

• 选中一个或多个 ROI 后，点击主工具栏窗口上的 Analyze > Tools > ROI Manager...。
• 在 ROI Manager 窗口中，点击 Add [t] (Add to list, 快捷键 t) 将当前选区添加到列表中。
• 列表中的每个条目代表一个保存的 ROI。您可以：
  • 点击列表中的 ROI 查看其在图像上的位置。
  • 按住 Shift 或 Ctrl/Cmd 键选择多个 ROI。
  • 点击 Measure 对选中的 ROI 进行测量。
  • 点击 Show All 显示所有列表中的 ROI。
  • 点击 Deselect 取消选中所有 ROI。
  • 点击 Delete 删除选中的 ROI。
  • 点击 Save... 保存 ROI 列表（为 .zip 文件）。
  • 点击 Open... 加载保存的 ROI 列表。

7. 使用 Image Stacks 和 Hyperstacks

ImageJ 可以处理多层图像数据，称为 Stacks (堆栈)。这些层可以是不同焦平面 (Z-stack)、不同时间点 (Time-lapse) 或不同通道 (Color channels)。Hyperstacks 是一种更高级的堆栈，可以同时包含 Z、时间、通道等多个维度。

• 如果您的图像是堆栈，图像窗口的标题栏会显示层数（例如 “image.tif (1/50)” 表示总共 50 层，当前在第 1 层）。
• 图像窗口的下方会有一个滑动条，用于在不同的层之间切换。您也可以使用键盘的左右箭头键进行切换。
• Image > Stacks > 菜单提供了处理堆栈的各种功能，如：
  • Z Project...: 将堆栈沿 Z 轴投影，生成一个二维图像（如最大投影、平均投影等）。常用于显示整个 Z 栈中的信号。
  • Convert Stack to Images: 将堆栈的每一层分离成单独的图像文件。
  • Convert Images to Stack: 将多个单独的图像文件组合成一个堆栈。
• Image > Hyperstacks > 菜单用于处理更复杂的多维度数据。

第四部分：进阶功能与自动化

为了应对更复杂的分析任务和提高效率，ImageJ 提供了强大的扩展和自动化能力。

1. 插件 (Plugins)

插件是 ImageJ 功能扩展的主要方式。Fiji 预装了大量常用的插件，涵盖了图像分割、三维可视化、机器学习、专业图像格式读取等方面。

• 查找插件： 您可以通过 Fiji 的更新管理器查找和安装更多插件（Help > Update...）。在更新器窗口中，您可以选择激活不同的更新站点，这些站点提供了各种第三方开发的插件。
• 安装插件： 对于不在更新站点上的插件（通常是 .jar 文件），您可以将其复制到 Fiji 文件夹下的 plugins 子文件夹中，然后重启 ImageJ 即可加载。
• 使用插件： 安装的插件通常会出现在 Plugins 菜单下的新子菜单中。

一些常见的、功能强大的插件系列包括：

• Analyze > Tools > ROI Manager: (前面已介绍，其实本身也是一个核心插件)
• Process > HDR: 用于处理高动态范围图像。
• Plugins > Registration: 图像配准插件，用于对齐多张图像（如时间序列或不同视野）。
• Plugins > Segmentation: 各种高级分割算法，如 Watershed、Trainable Weka Segmentation (基于机器学习的分割)。
• Plugins > 3D Viewer: 三维可视化插件。
• Plugins > Analyze > Coloc 2: 用于分析图像中的共定位。

2. 宏 (Macros)

宏是一系列 ImageJ 命令的脚本。通过录制宏或编写宏脚本，您可以自动化重复性的图像处理和分析任务。

• 录制宏： 如果您需要对一组图像执行相同的操作序列（如打开、滤波、阈值化、Analyze Particles），可以使用宏录制器。
  • 点击菜单 Plugins > Macros > Record...。
  • 在弹出的录制器窗口中，点击 Record。
  • 然后正常执行您想录制的操作（通过菜单、工具栏或快捷键）。
  • 完成操作后，点击录制器窗口的 Stop。
  • 录制器窗口会显示相应操作的宏代码。您可以点击 Create 将代码保存为 .ijm 文件。
• 运行宏：
  • 点击菜单 Plugins > Macros > Run...，选择您保存的宏文件。
  • 或者将宏文件拖放到 ImageJ 主工具栏窗口上。
• 编辑宏： 您可以通过 Plugins > Macros > Edit... 打开宏编辑器，查看和修改宏代码。宏语言相对简单，即使没有编程基础，通过录制和修改也能完成很多任务。

宏是批量处理图像、确保分析流程一致性的强大工具，对于处理大量图像数据时尤为重要。

第五部分：ImageJ 使用技巧与最佳实践

• 先设置标定： 如果您的分析需要实际单位的测量结果，务必在进行任何测量之前设置空间标定。
• 保留原始数据： 在进行任何可能改变像素值的操作（如滤波、阈值化、调整亮度/对比度并应用）之前，始终保存原始图像的副本。
• 非破坏性操作优先： 尽量利用 ImageJ 中非破坏性的功能（如只影响显示的亮度/对比度调整）进行观察和初步判断。只有在需要进行定量分析时，才应用那些改变像素值的操作。
• 了解您的数据： 在分析前，花时间检查您的图像数据，了解其位深、通道、维度、潜在的噪声来源等，这有助于选择合适的处理和分析方法。
• 逐步分析： 将复杂的分析任务分解为一系列简单的步骤（如滤波 -> 阈值化 -> 分析颗粒）。
• 记录分析步骤： 对于重要的分析，详细记录您使用的 ImageJ 版本、插件版本、每个操作的参数设置，以便日后查验和重复。宏是记录和重复分析流程的绝佳方式。
• 利用状态栏信息： 状态栏会显示光标位置的像素坐标和灰度值，以及当前图像的属性和标定信息，这在检查和调试时非常有用。
• 探索菜单： ImageJ 的功能非常丰富，多花时间浏览各个菜单项，了解其提供的功能。
• 查阅文档和社区： ImageJ 有详细的在线文档和活跃的用户社区论坛。遇到问题时，搜索官方文档或在论坛提问通常能找到解决方案。Fiji 网站提供了大量的教程。
• 学习宏语言： 虽然不是必须的，但学习一点宏语言能极大地提升您的自动化能力和解决问题的灵活性。

第六部分：总结与展望

ImageJ 作为一个免费、开源且功能强大的图像分析平台，为科研和工程领域提供了无限的可能性。本文从安装、基本操作讲起，详细介绍了图像处理、测量、计数、分割等核心分析技术，并探讨了插件和宏在扩展功能和自动化方面的作用。

掌握 ImageJ 需要时间和实践。从简单的任务开始，逐步尝试更复杂的功能，并积极利用其丰富的插件和宏库。通过不断学习和探索，您将能够充分发挥 ImageJ 的潜力，从您的图像数据中提取出有价值的定量信息，从而推动您的研究或项目向前发展。

ImageJ 的魅力不仅在于其现有的功能，更在于其开放的生态系统和活跃的社区。如果您有特定的分析需求，很有可能已经有插件可以满足，或者您也可以尝试通过宏或编写 Java 插件来实现。

希望这篇详细的指南能帮助您更好地理解和使用 ImageJ，祝您在图像分析的旅程中取得成功！

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